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Sep 12, 2023

Quantificação da fixação biológica de nitrogênio por Mo

Relatórios Científicos volume 12,

Scientific Reports volume 12, Número do artigo: 22011 (2022) Citar este artigo

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Detalhes das métricas

A fixação biológica de nitrogênio (BNF) por molibdênio canônico e vanádio complementar e isoformas de nitrogenase somente de ferro é a principal fonte natural de nitrogênio recém-fixado. Compreender os controles sobre o ciclo global de nitrogênio requer conhecimento da isoforma responsável pela BNF ambiental. O ensaio isotópico de redução de acetileno (ISARA), que mede o fracionamento de isótopos estáveis ​​de carbono (13C/12C) entre etileno e acetileno em ensaios de redução de acetileno, é um dos poucos métodos que podem quantificar fluxos de BNF específicos de isoformas. A aplicação do ISARA clássico tem sido um desafio porque a atividade ambiental do BNF é frequentemente muito baixa para gerar etileno suficiente para análises isotópicas. Aqui nós descrevemos um método de alta sensibilidade para medir etileno δ13C por acoplamento em linha de pré-concentração de etileno para espectrometria de massa de cromatografia gasosa-combustão-isótopo (EPCon-GC-C-IRMS). Os requisitos de etileno em amostras com 10% v/v de acetileno são reduzidos de > 500 para ~ 20 ppmv (~ 2 ppmv com remoção prévia do acetileno off-line). Para aumentar a robustez reduzindo o erro de calibração, os mutantes Azotobacter vinelandii de isoforma de nitrogenase única e os ensaios de amostras ambientais dependem de uma fonte comum de acetileno para a produção de etileno. A aplicação do método ISARA de baixa atividade de BNF (LISARA) a solos com baixa atividade de fixação de nitrogênio, serapilheira, madeira deteriorada, criptógamas e cupins indica BNF complementar na maioria dos tipos de amostra, exigindo estudos adicionais de BNF específica de isoforma.

O nitrogênio (N) define fundamentalmente os limites da produtividade biológica, provavelmente restringindo as respostas dos ecossistemas naturais às mudanças ambientais globais1,2,3. A fixação biológica de nitrogênio (BNF), o processo procariótico que converte o dinitrogênio atmosférico (N2) em amônia, é a principal entrada biológica de novo N biodisponível para os orçamentos globais e regionais de N. Assim, desempenha uma função biogeoquímica chave em diversos ecossistemas, incluindo florestas tropicais, temperadas e de alta latitude, gramíneas montanas e matagais, bem como ambientes bentônicos e de oceano aberto4,5. A nitrogenase, a metaloenzima responsável pela BNF, existe em três isoformas primárias, caracterizadas pelo metal de transição presente no sítio ativo: a nitrogenase canônica e a 'alternativa', ou mais recentemente denominada 'complementar' vanádio (V)-somente e ferro ( Fe)-apenas nitrogenases6,7. As nitrogenases somente V e Fe são independentes de Mo, contendo os metais traços mais abundantes de origem crustal V e Fe no lugar de Mo8.

Determinar a contribuição das diferentes isoformas de nitrogenase para BNF ambiental é fundamental para a compreensão dos controles mecanísticos no ecossistema BNF, particularmente como os ciclos biogeoquímicos acoplados de macronutrientes e metais traços biologicamente ativos respondem a perturbações antropogênicas. Como os cálculos da taxa de BNF com base em métodos tradicionais (ou seja, ensaios de redução de acetileno e métodos de abundância natural 15N/14N) são sensíveis à isoforma da nitrogenase9,10,11, a atribuição incorreta das isoformas de nitrogenase ativas na BNF pode alterar as estimativas de orçamento de N em até tanto quanto 50%12,13, influenciando o status e o manejo do N do ecossistema.

A especificidade do metal dos fluxos ambientais de BNF agora pode ser avaliada com a aplicação de rastreamento de fluxo específico de isoforma por meio do ensaio isotópico de redução de acetileno (ISARA) e métodos de rendimento de etano combinados com análises de sequência de genes de nitrogenase6,12,13,14. Essas abordagens identificaram contribuições significativas de nitrogenases complementares V e Fe apenas para BNF não rizóbio em diversas amostras que variam de serapilheira de mangue Everglade temperada, sedimentos de pântanos salgados costeiros temperados e cyanolichens12,13,15,16 boreais. Mais recentemente, um estudo de cyanolichen BNF em um gradiente de nutrientes de floresta boreal de 600 km forneceu a primeira evidência em escala de ecossistema para o papel da V-nitrogenase na manutenção de entradas de BNF sob condições limitadas de Mo13, validando uma hipótese de longa data sobre o "backup" papel das nitrogenases complementares originalmente sugerido por estudos de laboratório17. Além disso, baixas taxas de atividade de redução de acetileno para nitrogênio (ou seja, taxas de R), sugestivas de BNF complementar, foram observadas para solo temperado9, musgo boreal11,18 e madeira em decomposição19. Além disso, genes de nitrogenase complementares e não caracterizados foram detectados em cobertura morta de madeira20, intestino posterior de cupins21, solo9, musgo22 e cianolíquens23,24. Esses estudos, juntamente com o acúmulo de exemplos de BNF limitada por Mo em biomas de floresta boreal18,25,26, temperada e tropical27,28,29,30,31,32,33, sugerem que BNF complementar independente de Mo poderia desempenhar um papel global. No entanto, a quantificação das taxas de BNF independentes de Mo em amostras ambientais, que muitas vezes têm baixa atividade de BNF, tem sido um desafio, pois o método mais confiável para atribuição de BNF complementar, ISARA12, requer rendimentos de etileno muito mais altos do que os normalmente observados (por exemplo, solo, musgo , a serapilheira geralmente gera < 300 ppmv de etileno em incubações de ensaio de redução de acetileno de 1 a 2 dias). Um estudo mais amplo de BNF complementar e seus controles dentro de ecossistemas importantes requerem melhorias metodológicas do ISARA.

 500 ppmv). Secondly, acetylene measurements (δ13Cacetylene) often have large uncertainties due to peak tailing and memory effects, which necessitates frequent GC column conditioning (i.e., a brief increase of temperature to remove water, acetylene, and any other analytes accumulated on the column) and combustion reactor oxidations in which pure O2 is flushed into the reactor at high temperature to regenerate the reactor's oxidative capacity. Finally, ethylene and acetylene isotope measurements are calibrated to the VPDB international carbon isotope reference scale using methane isotope standards because no ethylene standards with NIST traceable δ13C values exist. Deviations in chemical behavior between the methane standard and target analytes, ethylene and acetylene, during chromatographic separation and combustion can lead to biases during drift correction along and across multiple sample runs comprised of replicate measurements. The classical ISARA method is thus relatively time-consuming and limited to samples with high BNF activity./p> 500 ppmv) in 10% v/v acetylene were manually injected into a Thermo Scientific Trace GC Ultra-Isolink with an Agilent HP-PLOT/Q capillary GC column (30 m, i.d. = 0.32 mm, f.t. = 20 μm) and a combustion reactor connected to a Thermo Scientific Delta V Plus isotope ratio mass spectrometer (GC-C-IRMS; Fig. 1a). Modifications include the replacement of silver ferrules in the GC oven with Valcon polymide (graphite reinforced polymer) ferrules to limit memory effects from acetylene. The combustion reactor was oxidized with pure oxygen for 1 h before each run and brief (15 min) seed oxidations were performed between measurement batches (i.e., required every ~ 6–8 ethylene injections, ~ 4–6 acetylene injections) to regenerate reactor oxidation capacity and minimize drift of δ13C values. See Supplementary Table S1a online for additional instrument settings./p> 5000 ppmv (i.e., 5% of acetylene concentration), δ13Cethylene was also corrected for Rayleigh fractionation12,43./p> 100% (i.e., 100% FeNase is equivalent to ~ 140% VNase; Supplementary Table S4). Estimated uncertainty on the %FeNase scale is at most ~ 20%./p>

 23.6 nmol C. The larger volume allowance of the EPCon autosampler (20 mL) relative to the GC-C-IRMS sample inlet port (≤ 1 mL) and increased sensitivity enables measurement of gases with ≥ 0.7 ppmv ethylene in the absence of background acetylene. The minimum ethylene concentration for samples with a background of 10% v/v acetylene (typical ARA samples) is 9 ppmv, or 2 ppmv if background acetylene is removed by chemical precipitation prior to EPCon analyses. Conservatively, minimum working ethylene concentrations for ARA samples are 500 ppmv (direct injection), 20 ppmv (EPCon-GC-C-IRMS), and 5 ppmv (chemical precipitation + EPCon-GC-C-IRMS). The lower sensitivity of the direct injection GC-C-IRMS method is partly due to the necessary use of a high split-ratio within the sample injector port (40:1 – the proportion of sample and He carrier gas flow that is vented from the injection port relative to the proportion that enters the GC column) to fully resolve ethylene (~ a few to several hundred ppmv) and acetylene (~ 100,000 ppmv) peaks with our capillary GC column./p> 5 V) apparent during δ13Cethylene analyses exacerbated peak tailing problems, causing decreased δ13Cethylene precision (by as much as 5‰). GC column and combustion reactor reconditioning was required when excess acetylene was inadvertently introduced into the GC-C-IRMS (e.g., incomplete venting within EPCon)./p> 160% in the %VNase scale and > 120% in the %FeNase scale must be strongly influenced by processes unrelated to BNF (e.g. natural endogenous ethylene cycling—production or consumption, gas leakage from stoppers). Non-BNF related fractionation may explain the > 160% VNase values observed for certain samples of litter (n = 1), moss (n = 1), soil (n = 4), decayed wood (n = 2)./p> 500 ppmv and the requirement for δ13Cacetylene measurements. Further, the offline precipitation step to completely remove acetylene from ARA sample headspace would enable any microbiology or wet-chemistry lab to outsource ISARA analyses of ethylene from sample and single nitrogenase calibration ARAs run with the same source acetylene to other stable isotope analytical laboratories for δ13Cethylene measurements. We note that the comparability of absolute δ13C values across research groups may vary and be difficult to assess as multiple factors (e.g., type of GC column and oxidation reactor state) can influence absolute δ13C values. This makes the simultaneous analyses of single nitrogenase calibration ARAs and environmental samples particularly important./p> 5% of the ARA produced ethylene concentration for a given sample type and location) in 12 out of 93 "no acetylene added" control samples. All 12 samples that contained endogenous ethylene were incubated for 290 to 300 h (27 samples were incubated for that long). Another batch of 27 samples incubated for 165 to 175 h did not show signs of endogenous ethylene production. Acetylene has been reported to inhibit ethylene oxidation, thus "no acetylene added" control samples might not be sufficient to assess endogenous ethylene production in ARAs with very low ethylene yield (< 20 ppmv)50. Thus, we recommend incubating samples for ideally less than 60 h when conducting an ISARA or LISARA surveys. Overall, the low endogenous ethylene production rate from our samples during incubations (Supplementary Table S3), and the similarity among isotopic signatures obtained for each sample type over four sites, 2 years, and various incubation times (2–300 h) indicates that natural ethylene cycling has minimal influence on our reported results./p>